Perintötekijät alkoholivaurioiden taustalla

Viimeisestä kirjoituksesta on vierähtänyt aikaa, ja se aika on käytetty pitkälti laboratoriossa tutkien epiFASD-projektimme näytteitä. Tässä projektissa olemme keränneet synnytysten yhteydessä näytteitä raskauden aikana alkoholille altistuneiden vastasyntyneiden lasten istukasta, istukkaverestä ja pyyhkäisynäytteitä posken sisäpinnalta. Lisäksi olemme keränneet vastaavia näytteitä verrokeista, jotka eivät ole altistuneet alkoholille. Nyt olemme saaneet ensimmäisen työn istukoista valmiiksi ja mitä yllättävää niistä löytyikään!

Alkoholialtistus vaikuttaa vastasyntyneiden pään kokoon

Tähän työhön olimme keränneet näytteitä 39 alkoholille altistuneelta ja 100 verrokki-vastasyntyneeltä. Alkoholin tiedetään aiheuttavan pienikasvuisuutta ja altistuksen on huomattu vaikuttavan erityisesti pään kasvuun. Vertailimme tutkimuslastemme kokoa käyttäen apuna uusia suomalaisia kasvukäyriä, joita käyttämällä voidaan sulkea pois vaihtelu raskauden kestossa, monesko lapsi on äidille ja lapsen sukupuoli, jotka kaikki vaikuttavat lapsen kasvuun. Yllätykseksemme havaitsimme hyvin vähäisiä eroja näiden kahden ryhmän välillä syntymäpainoissa, syntymäpituuksissa ja istukoiden painoissa. Alkoholille altistuneiden lasten päänympärykset olivat keskimäärin kuitenkin lähes tilastollisesti merkittävästi verrokkeja pienempiä, joka viittasi alkoholin vaikuttavan juuri pään kasvuun myös meidän aineistossamme.

Kasvuun vaikuttava geenialue IGF2/H19

Koska raskaudenaikainen alkoholialtistus (prenatal alcohol exposure, PAE) aiheuttaa pienikasvuisuutta, lähdimme tutkimaan geenialuetta, lokusta, jonka tiedetään vaikuttavan istukan ja sikiön kasvuun. Tämä kromosomissa 11 sijaitseva Insuliininkaltainen kasvutekijä 2 (IGF2)/H19-lokus on epigeneettisesti säädelty ja siksi meidän näkökulmasta erityisen kiinnostava. Lokus on leimattu eli imprintattu, mikä tarkoittaa, että geenit toimivat sen mukaan ovatko ne peritty isältä tai äidiltä. Tässä kyseisessä lokuksessa toimii isältä peritty, kasvua voimistava IGF2 ja äidiltä peritty kasvua rajoittava H19. Näiden kahden geenin toimintaa on tutkittu paljon ja alueelta on löydetty erityinen säätelyalue, leimautumisen kontrollialue (imprinting control region, ICR). Tähän alueeseen sitoutuu säätelyproteiinit, jotka säätelevät lokuksen toimintaa eli geenien ilmenemistä. Tämän leimautumisen kontrollialueen epigeneettisten merkkien eli DNA-ketjuun sitoutuvien metyyliryhmien määrän on huomattu vaikuttavan geenien toimintaan. Aloitimme tutkimuksemme juuri tuosta alueesta ja otimme selvää vaikuttaako alkoholi tuon alueen DNA-ketjuun sitoutuvien metyyliryhmien määriin, mahdollisesti geenien toimintaan ja lasten kasvuun.

Muutokset epigenomissa, geenien ilmenemisessä ja vastasyntyneiden kasvussa

Jo ensimmäisissä metylaatiotutkimuksissa huomasimme osassa DNA-juostetta eroja näytteiden metylaatioryhmien määrien välillä, sekä alkoholille altistuneissa että verrokki-istukoissa. Tarkempi tarkastelu paljasti, että metyyliryhmien määriin näytti liittyvän säätelyalueen yhden emäksen G/A variaatio, snippi (single nucleotide polymorphism, SNP) nimeltä rs10732516 ja se, miten tämä variaatio oli periytynyt isältä ja äidiltä. Tämän johtopäätöksen tueksi löysimme myös aiemmin julkaistun työn. Koska tämä variaatio näytti aiheuttavan jo melkoisesti vaihtelua metyylimäärässä näiden kahden ryhmän sisällä, tuntui väärältä verrata ryhmiä suoraan toisiinsa. Päätimme jakaa näytteet neljään ryhmään eli genotyyppiin sen mukaan, miten variaatio oli lapselle periytynyt: molemmilta vanhemmilta G (G/G), isältä G ja äidiltä A (patG/matA), isältä A ja äidiltä G (patA/matG) sekä molemmilta vanhemmilta A (A/A). Kummatkin emäkset, sekä G että A ovat yhtä yleisiä suomalaisessa väestössä ja onneksemme näytteet jakautuivatkin tasaisesti neljään tutkittavaan ryhmään. Epäonneksemme tämän jaon jälkeen kunkin ryhmän näytemäärä kutistui melko pieneksi.  

Muutoksia metylaatiossa
Jotta pystyimme erottamaan isältä ja äidiltä perityt DNA-juosteet toisistaan, tutkimme tarkemmin patG/matA- ja patA/matG-genotyypit perineiden lasten istukoita. Perinteistä bisulfiittisekvensointimenetelmää käyttämällä pystyimme erottamaan korkeasti metyloituneen isältä perityn juosteen vähän metyloituneesta äidiltä peritystä. Juosteen variaatio puolestaan kertoi lapsen genotyypin sekä varmisti kummalta vanhemmalta kukin juoste oli peritty. Kun vertasimme erikseen äidiltä ja isältä perittyjen juosteiden metyyliryhmien määrää alkoholille altistuneiden ja verrokkien välillä, huomasimme normaalisti korkeasti metyloituneen isältä perityn juosteen olevan huomattavasti heikommin metyloitunut alkoholille altistuneissa patA/matG-genotyypin istukoissa kuin verrokeissa (kuva 1). Samaa muutosta emme havainneet patG/matA-genotyypin istukoissa. Tämä voi äkkiseltään kuulostaa monimutkaiselta, mutta tämä yksinkertaistettuna viittasi siihen, että alkoholi vaikutti erilailla DNA-juosteeseen sitoutuneisiin metyyliryhmiin sen mukaan, mitkä variaatiot lapsi on vanhemmiltaan perinyt. Tuloksesta yllättyneinä lähdimme tutkimaan, voiko nämä genotyypistä riippuvat muutokset aiheuttaa myös genotyyppikohtaisia muutoksia geenien toiminnassa ja lapsen kasvussa.

Kuva 1. Isältä A-geenimuodon ja äidiltään G-geenimuodon (paternaalinen A/maternaalinen G) perineiden alkoholille altistuneiden lasten istukoissa oli isältä perityssä normaalisti korkeasti metyloituneessa DNA-juosteessa vähemmän metyyliryhmiä kuin verrokeilla. Samanlaista muutosta ei nähty paternaalinen G/maternaalinen A yhdistelmän perineiden lasten istukoissa. Mustat pylväät kuvaavat verrokki-istukoita ja harmaan alkoholille altistuneita. Näytemäärät ovat suluissa. Tähdillä on merkityt metyyliryhmien sitoutumiskohdat poikkeavat merkittävästi toisistaan (nimellinen p-arvo<0.05).

Muutoksia geenien toiminnassa
Seuraavaksi tutkimme oliko alkoholialtistus vaikuttanut IGF2- ja H19-geenien toimintaan. Aiemmin altistuksen vaikutusta IGF2-geenin toimintaan ihmisistukassa on tutkittu Espanjassa ja tulos oli ristiriitainen: tämän kasvua tehostavan geenin toiminta oli kasvanut merkittävästi pienikasvuisuutta aiheuttavan alkoholin vaikutuksesta. Työmme vahvisti espanjalaisten havaintoa: myös meidän aineistomme alkoholille altistuneissa istukoissa IGF2-geenin toiminta oli kasvanut. Tutkimme lisäksi H19-geenin toimintaa ja huomasimme, että tämän kasvua rajoittavan geenin toiminta oli lisääntynyt merkittävästi kussakin istukassa suhteessa IGF2-geeniin (kuva 2). Tuloksemme vaikuttaisi loogiselta: kummankin geenin toiminta on lisääntynyt alkoholin vaikutuksesta, mutta  jostain syystä kasvua rajoittavan H19-geenin enemmän, mikä puolestaan selittäisi pienikasvuisuutta.

Kuva 2. Kasvua rajoittavan H19-geenin toiminta oli merkittävästi lisääntynyt alkoholille altistuneissa istukoissa (harmaa pylväs) sitä verrattiin istukkakohtaisesti kasvua lisäävään IGF2-geenin toimintaan.

Muutoksia lasten pään koossa

Lopuksi tarkastelimme lasten suhteellisia syntymämittoja näiden neljän genotyypin mukaan. Yllätykseksemme genotyyppikohtaiset erot alkoholille altistuneiden lasten pään ympäryksissä olivat suuret (kuva 3). Erityisen silmiinpistävää oli genotyypin A/A pään koot, jotka yhtä lukuun ottamatta olivat suomalaista keskiarvoa suuremmat alkoholialtistuksesta huolimatta. Lisäksi oli mielenkiintoista huomata, että pienimmät päät olivat genotyypeillä G/G ja patG/matA, joilla myös kasvua rajoittavan H19-geenin toiminta oli merkittävästi kohonnut suhteessa IGF2-geeniin.

Kuva 3. Tutkimuksessa mukana olleiden lasten päänympärysten keskihajonta. Lapset on jaettu genotyyppien mukaisesti neljään ryhmään: G/G-, isältä peritty G/äidiltä peritty A (patG/matA)-, isältä peritty A/äidiltä peritty G (patA/matG)- ja A/A-genotyypit. Mustat pisteet (C) kuvaavat verrokkeja ja harmaat (A) alkoholille altistuneita. Näytteiden lukumäärät ovat suluissa. A/A-genotyypin alkoholille altistuneiden lasten päänympärykset poikkeava merkittävästi G/G- ja patG/matA-genotyypeistä (Bonferroni post hoc testi yksi suuntaiselle ANOVAlle: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P ≤ 0.001).

Perintötekijämme vaikuttavat alkoholialtistuksen seurauksiin

Mitä nämä tutkimuksemme tulokset sitten kertovat meille? Löytämämme genotyyppikohtaiset muutokset vahvistavat, että alkoholialtistuksen vaikutukset elämämme alkumetreillä riippuvat osaksi perintötekijöistämme. Perimän rooli alkoholivaurioissa on kaksostutkimusten ja geneettisten kokeiden perusteella tiedetty jo kauan, mutta kokeet ovat keskittyneet lähinnä alkoholin metaboliaan vaikuttaviin geeneihin eikä mitään konkreettista lapsen ilmiasuun liittyvää ole vielä löydetty.

Tuloksemme eivät kerro mekanismia, jolla alkoholi vaikuttaa tämän monimutkaisesti säädellyn lokuksen toimintaan. Löytämämme muutokset metyyliryhmien määrässä ovat säännönmukaisia, mutta suhteellisen pieniä ja niiden biologisen merkittävyyden selvittämiseen tarvitaan lisää tutkimusta. Toisaalta, vaikka ne eivät itsessään vaikuttaisikaan lokuksen säätelyyn, ne voivat heijastaa muutoksia muilla säätelyn tasoilla. Ehkä tarvittava säätelyproteiini ei pääsekään sitoutumaan sitoutumiskohdassa sijaitsevan variaation ansiosta samalla tavalla leimauksen kontrollialueeseen kaikissa genotyypeissä. Erot voivat olla hyvin pieniä normaalioloissa, mutta epäedullisissa kasvuolosuhteissa huomattavia. Meidän täytyy myös muistaa lokuksen suuri merkitys normaaliin kasvuun ja kehitykseen: löytämämme muutokset molekulaarisella tasolla näyttävät pieniltä, mutta eivät ne ole suuren suuria lasten ilmiasussakaan. Todennäköisesti suuret muutokset näin merkittävän lokuksen säätelyssä aiheuttaisivat huomattavasti suurempia ongelmia sikiönkehityksessä.

Näiden tulosten pohjalta emme voi päätellä mitään syy-seuraus-suhteista, että esimerkiksi muutos metyyliryhmissä aiheuttaisi tietynlaisen muutoksen geenien toiminnassa ja lapsen kasvussa. Tähän tarvitaan lisää tutkimuksia. Lisäksi toivomme, että kaikki raskaudenaikaista alkoholialtistusta tutkivat tarkastelisivat omia näytteitään tämän uuden tiedon valossa. Näytemäärä työssämme on pieni, mikä luonnollisesti kasvattaa sattuman mahdollisuutta. Kukin työmme osa-alue kuitenkin toi esiin alkoholialtistukseen kytkeytyviä genotyyppikohtaisia muutoksia ja osa muutoksista vahvisti aiempia tuloksia.   

Apua vaurioiden diagnosointiin

Pientä pään ympärystä on pidetty merkkinä raskaudenaikaisen alkoholialtistuksen aiheuttamista vaurioista. Työmme perusteella alkoholille altistuneen lapsen perimä vaikuttaa pään ympärykseen ja siksi pään koko ei ole luotettava alkoholivaurioiden merkki. Tuloksemme voisi selittää aiempien tutkimusten ristiriitaiset tulokset äidin alkoholinkäytön suhteesta lapsen pään kokoon sekä heikon korrelaation alkoholille altistuneiden lasten pään ja aivojen koon välillä sekä pään koon ja kognitiivisten kykyjen välillä. Ehkä alkoholi vaurioittaa kehittyviä aivoja kaikissa genotyypeissä, mutta se ei näy aina pään koossa.

Työmme on askel kohti alkoholivaurioiden mekanismien ymmärtämistä. Alkoholi voi aiheuttaa laajan kirjon erilaisia sikiövaurioita ja vaurioiden syntyyn vaikuttaa lukemattomat tekijät, perimän lisäksi esimerkiksi altistusajankohta, annos, määrä, toistuvuus, lääkkeet ja muu päihteiden käyttö. Tämä löytömme rohkaisee eteenpäin kohti tavoitettamme kehittää työkalu alkoholivaurioiden luotettavaan diagnosointiin. Tällä hetkellä diagnosointi on erittäin vaikeaa, ellei mahdotonta, ja tarve luotettaville menetelmille on suuri.

Epigeneettinen lähestymistapa

Kun aloitimme työt IGF2/H19-lokuksen parissa kolmisen vuotta sitten, emme voineet kuvitella, että me ensikertalaiset löytäisimme jotain näin mielenkiintoista. Epigeneettisen lähestymistapamme ansiosta katsoimme lokusta uudella tavalla ja löysimme ympäristön aiheuttamia genotyyppikohtaisia muutoksia. Ja kyse on yhdestä eniten tutkitusta kasvuun ja kehitykseen vaikuttavasta lokuksesta! Nyt toivomme, että tulostemme innoittamina muutkin tästä lokuksesta ja sikiön kasvusta kiinnostuneet tutkijat ottavat huomioon genotyypit tulevissa tutkimuksissaan tai analysoivat uudelleen jo julkaistuja töitään. Näin voi paljastua yllättäviäkin asioita ympäristön vaikutuksesta sikiön kehitykseen.

Työmme on vapaasti luettavissa Human Reproduction Open-julkaisusarjassa:
Heidi Marjonen, Hanna Kahila, Nina Kaminen-Ahola; rs10732516 polymorphism at the IGF2/H19 locus associates with a genotype-specific trend in placental DNA methylation and head circumference of prenatally alcohol-exposed newborns, Human Reproduction Open, Volume 2017, Issue 3, 5 October 2017, hox014, https://doi.org/10.1093/hropen/hox014